牛痘病毒加帽体系

牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将 7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5´末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有用的方法，且帽结构与自然Cap 0结构一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。这种酶由两个亚基（D1 和D12）组成，D1亚基执行RNA三磷酸酶和鸟苷转移酶的功能，D12亚基执行鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的。 

本体系可用于IVT RNA的加帽反应，使加帽反应在1h之内完成，效率接近完整，并且保证正确的方向。IVT推荐使用蛋白质T7 High Yield RNA Transcription kit。

体内或体外翻译前 mRNA的加帽和mRNA的5’末端标记。

SAM：需事先计算好SAM的用量，在反应开始前把分装的32mM的储备液稀释成2mM的工作液。SAM在pH7-8，37°C条件下不稳定，需要在反应开始之前新鲜配置。为避免SAM降解，该工作液需要保存于冰上。 

RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的RNA进行纯化并溶解于RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA溶液或其他盐溶液中。 

RNA 二级结构：一些RNA转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热RNA可以去除转录产物5´端的二级结构，如果转录产物的5´端结构复杂，可以把加热时间延长到10min，加帽反应时间可延长到60min。 

Cap 0-和Cap 1-mRNA：Cap 0-和Cap 1-mRNA之间的差异在RNA 5'端紧邻帽结构的一位核苷酸（N1）是否具有 2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是自然加帽过程的一部分，Cap 1结构提高了mRNA的翻译效率。 

Vaccinia Capping System可以与mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase在一个体系内同时工作产生Cap 1结构。当使用新的细胞系或翻译系统时，建议比较Cap 0-和Cap 1-mRNA翻译效率和免疫原性，以确定合适的帽子结构。 

Poly(A) 尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用蛋白质E.coli. Poly(A) Polymerase进行加尾。加帽和加尾后的RNA需在进行RNA转染实验前做纯化处理。 

RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入0.5µl蛋白质RNase inhibitor，同时去掉等体积的RNase-free水。 

RNA5’端标记：在用于RNA 5´端标记时，GTP 储备液应稀释到mRNA 浓度的 1-3 倍。