蛋白A（Protein A） 残留检测试剂盒

简介

抗体类药物生产时多用到的蛋白A（Protein A）亲和层析填料，不可避免会有蛋白A配基脱落，导致抗体药物中蛋白A的残留污染。本试剂盒既可检测天然的protein A，也可检测重组的protein A如MabSelect SuRe等，适用于定量分析生物药物中蛋白A杂质。

优势

通常情况下，蛋白A会与待测样品中的单克隆抗体形成复合体从而影响准确的蛋白A测定，与传统方法相比，本试剂盒无需样品预处理步骤，即可检测从IgG中分离的蛋白A，实验简单易操作，且耗时短。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫检测技术测定样品中proteinA的含量。包括校准品，标准品，稀释液，

Biotin标记的检测抗体，清洗液，双组分TMB显色液，终止液，预包被酶标板，封板膜。

使用方法

试剂准备

1.本试剂对水份敏感，在开瓶前，需将各组分小瓶完全平衡至室温，以避免容器内的水份冷凝。

2.清洗液的配制：用蒸馏水或纯化水10倍(1:9)稀释试剂E 清洗液(10X),配制实验用清洗液。长期使用可放于2℃~8℃保存，效期3个月。

3.设置酶标仪，读取波长450nm/630nm的双波长。

4.显色液的配制：双组份TMB显色液由两部分组成：组分A(含H2O2)和组分B(含TMB),分瓶包装，临用前按1:1混合后使用。

5.校准品的配制：检测含有天然或重组Protein A样品时，请参照下表稀释步骤配制出标准曲线：3000.00pg/mL、1500.00pg/mL、800.00pg/mL、320.00pg/mL、128.00pg/mL、51.20pg/mL 、20.48pg/mL、0.00pg/mL。

6.样品的配制： 

通常情况下，Protein A会与待测样品中的抗体形成复合体，而高浓度IgG会影响检测结果，从而影响Protein A的准确测定。因此在测定Protein A之前应当进行样品稀释。推荐用试剂B稀释液，将样品稀释至0.1-1.0mg/mL的蛋白浓度，可尝试将样品10-50倍稀释，或稀释至检测线性范围的浓度进行检测，稀释完的样品体积应不少于150μL。

未提供的必需品

1.具有450nm和630nm双波长检测功能的酶标仪。 (如果酶标仪不能提供双波长分析，也可以仅在450nm波长下读取)。

2.移液器5-200μLg

3.多通道移液器100μL。

4.蒸馏水或纯化水。

5.用于稀释清洗液的500mL容器。

检测操作步骤

1.取所需数量的组份H预包被酶标板条固定于板架上；向孔中加入校准品/待测样品，每孔50μL,每个浓度两个重复；

2.轻轻震荡混匀，贴上组份I封板膜，20-25℃振荡(500rpm)孵育60分钟；

3.洗板：甩净孔中液体，在各反应孔中加入稀释后的实验用清洗液(由试剂E清洗液稀释后配制),每孔300μL,停留5秒钟后甩去孔中液体，重复3次，最后一次甩净拍干。机洗：每孔中注液量为每孔300μL,洗板3次，最后一次拍干；

4.加入试剂C Biotin标记的检测抗体，每孔100μL；

5.轻轻震荡混匀，贴上组份I封板膜，20-25℃振荡(500rpm)孵育60分钟；

6.洗板：甩净孔中液体，在各反应孔中加入稀释后的实验用清洗液(由试剂E清洗液稀释后配制),每孔300μL,停留5秒钟后甩去孔中液体，重复3次，最后一次甩净拍干。机洗：每孔中注液量为每孔300μL,洗板3次，最后一次拍干；

7.加入试剂D链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物，每孔100μL；

8.轻轻震荡混匀，贴上组份I封板膜，20-25℃振荡(500rpm)孵育30分钟；

9.洗板：甩净孔中液体，在各反应孔中加入稀释后的实验用清洗液(由试剂E清洗液稀释后配制)每孔300μL,停留5秒钟后甩去孔中液体，重复3次，最后一次甩净拍干。机洗：每孔中注液量为每孔300μL,洗板3次，最后一次拍干；

10.显色：加入试剂F显色液，每孔100μL,20-25℃,避光孵育8分钟；

11.终止：加入试剂G终止液，每孔100μL,终止反应(此时蓝色立刻转为黄色);

12.测定：用酶标仪在450nm/630nm双波长下，读取各孔的吸光值(O.D.值),如果酶标仪不提供双波长分析，可以仅在450nm波长下读取，测定应在加入终止液后15分钟以内进行。

结果分析与计算

1.校准品、待测样品均做2个重复，取其平均值。

2.用酶标仪的自带软件(通常是四参数逻辑曲线拟合)或使用能够生成四参数逻辑拟合(log-4PL)的计算机软件制作校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待测样品的O.D.值从回归曲线上返算出样品中待测物的浓度。

3.请勿使用线性回归分析来推导样品浓度，避免导致结果不准。

4.含有大于3000pg/mL的Protein A样品需用所提供的试剂B稀释液稀释后测定。计算结果时，需将稀释后的样品浓度乘以稀释倍数。