胰蛋白酶残留检测试剂盒(酶联免疫吸附法)

简介

胰蛋白酶(Trypsin),是胰脏分泌的一种丝氨酸肽链内切酶，可切割赖氨酸及精氨酸C末端形成的肽键。作为一种重要消化酶，胰蛋白酶广泛应用于蛋白质的酶解/测序、组织/细胞的消化、胰岛素的生产等各研究领域。在疫苗和病毒载体的研发和生产过程中，贴壁细胞的培养是其中的关键步骤。中国药典(2020)在生物制品通则中将胰蛋白酶列为中等风险原料，因此对于涉及到用胰蛋白酶消化的工艺阶段需要进行胰蛋白酶的检测。

本试剂盒可检测天然或重组的猪源胰蛋白酶，并做为胰蛋白酶残留的评估，具有较高的检测灵敏度与较宽的线性范围。应用于生物制药工艺开发、生产过程或产品原液的胰蛋白酶残留检测。

 本试剂盒仅用于科研和生产过程控制，不能用于人类和动物的医学诊断。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫检测技术测定样品中胰蛋白酶的微量残留。

组分说明

使用方法

试剂准备

1.本试剂对水份敏感，在开瓶前，需将各组分小瓶完全平衡至室温，以避免容器内的水份冷凝。

2.清洗液的配制：用蒸馏水或纯化水10倍(1:9)稀释试剂E清洗液(10X)，配制实验用清洗液。长期使用可放于2℃~8℃保存，效期3个月。

3.设置酶标仪，读取波长450nm/630nm的双波长。

4.显色液的配制：双组份TMB显色液由两部分组成：组分A(含H2O2)和组分B(含TMB),分瓶包装，临用前按1:1混合后使用。

5.校准品的配制：取出试剂盒中的试剂A校准品(冻干品),加入1mL纯水复溶混匀，混匀后按照下表与图示，梯度稀释至5000pg/mL,2000pg/mL,1000pg/mL,500pg/mL,200pg/mL,80pg/mL,32pg/mL,0pg/mL。

6.样品的配制：

样品可用所提供的试剂B稀释液稀释至检测的线性范围内，每个浓度点应最少配制250μL。计算结果时，需将稀释后的样品浓度乘以稀释倍数。

未提供的必需品

1.具有450nm和630nm双波长检测功能的酶标仪。 (如果酶标仪不能提供双波长分析，也可以仅在450nm波长下读取)。

2.移液器5-200μLg

3.多通道移液器100μL。

4.蒸馏水或纯化水。

5.用于稀释清洗液的500mL容器。

检测操作步骤

1.取所需数量的组份H预包被酶标板条固定于板架上；向孔中加入校准品/待测样品，每孔100μL,每个浓度两个重复；

2.轻轻震荡混匀，贴上封板膜，37℃孵育60分钟；

3.洗板：甩净孔中液体，在各反应孔中加入稀释后的实验用清洗液(由试剂E清洗液稀释后配制),每孔300μL,停留5秒钟后甩去孔中液体，重复3次，最后一次甩净拍干。机洗：每孔中注液量为每孔300μL,洗板3次，最后一次拍干；

4.加入试剂C Biotin标记的检测抗体，每孔100μL；

5.轻轻震荡混匀，贴上封板膜，37℃孵育60分钟；

6.洗板：甩净孔中液体，在各反应孔中加入稀释后的实验用清洗液(由试剂E清洗液稀释后配制),每孔300μL,停留5秒钟后甩去孔中液体，重复3次，最后一次甩净拍干。机洗：每孔中注液量为每孔300μL,洗板3次，最后一次拍干；

7.加入试剂D链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物，每孔100μL；

8.轻轻震荡混匀，贴上封板膜，37℃孵育60分钟；

9.洗板：甩净孔中液体，在各反应孔中加入稀释后的实验用清洗液(由试剂E清洗液稀释后配制)每孔300μL,停留5秒钟后甩去孔中液体，重复3次，最后一次甩净拍干。机洗：每孔中注液量为每孔300μL,洗板3次，最后一次拍干；

10.显色：加入试剂F显色液，每孔100μL,20-25℃,避光孵育15分钟；

11.终止：加入试剂G终止液，每孔100μL,终止反应(此时蓝色立刻转为黄色);

12.测定：用酶标仪在450nm/630nm双波长下，读取各孔的吸光值(O.D.值),如果酶标仪不提供双波长分析，可以仅在450nm波长下读取，测定应在加入终止液后15分钟以内进行。

结果分析与计算

1.校准品、待测样品均做2个重复，取其平均值。

2.用酶标仪的自带软件(通常是四参数逻辑曲线拟合)或使用能够生成四参数逻辑拟合(log-4PL)的计算机软件制作校准品剂量-反应曲线的回归方程，再根据待测样品的O.D.值从回归曲线上返算出样品中待测物的浓度。

3.请勿使用线性回归分析来推导样品浓度，避免导致结果不准。

4.含有大于5000pg/mL的样品需用所提供的试剂B稀释液稀释后测定。计算结果时，需将稀释后的样品浓度乘以稀释倍数。

检验方法的局限性

1.本品仅适用于Trypsin(猪源胰蛋白酶)残留检测。

2.样品pH应保证在6.0-8.0之间，过低或过高的pH可能会造成测量值异常。

注意事项

1.本试剂盒适合由合格的技术人员操作使用。

2.将试剂盒从冷藏环境中取出并在室温下平衡20分钟后方可使用。

3.为了避免试剂、移液枪头和平板的交叉污染，应使用一次性的移液枪头和试剂容器。未用完的试剂不要重新倒回试剂瓶或试剂管中，注意不要把不同试剂瓶的盖子弄混而造成交叉污染。

4.加样：每次加样的时间最好控制在5分钟以内，推荐设置复孔，如果样本数量多，推荐使用排枪加样。

5.请于每次测定时，同时做标准曲线（复孔）。对于所有测定步骤，保持从一个孔到另一个孔的重复时间序列，以确保所有孔的孵育时间相同。且应尽可能快地完成所有步骤，以避免可能导致系统不准确的“运行结束”顺序过程时差。

6.孵育：为防止样品蒸发，实验室必须使用封板膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态，严格遵守给定的温育时间和温度。

7.洗板：洗涤过程中孔中残留的洗涤液应在吸水纸或无尘干布上拍干，请勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。

8.显色：样品数量较多，建议使用排枪，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔2分钟），如果梯度已经明显，可提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数；室温较低时，也可适当延长显色时间，以最高校准品浓度点的OD为2.0-2.5左右最佳。由于实验人员操作习惯与实验环境影响，本试剂盒的最高OD值可能会有所差异，此为正常现象，显色液请避光保存。

9.终止：终止试剂是酸性的，操作过程中需要格外注意，防止与皮肤和眼睛接触。

10.读板：上机读数前要用干净的纸巾轻轻擦拭酶标板底部，以清除残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数，读板过程中OD630nm波长为校正波长，若仪器存在差异，也可用650nm代替630nm。